Questo fa parte di un insieme di dati triplice copia di campi non sovrapposti di fibroblasti NIH 3T3 coltivate su polistirolo. Ogni insieme è indicata dal numero di pozzetto. Ogni immagine contiene 4 immagini di ogni campo, come una serie temporale. La prima immagine è l'immagine a contrasto di fase. Il secondo canale immagine è promotore Tenascin-C guidato destabilizzato EGFP giornalista vettoriale. La terza immagine è Texas Red C2-maleimmide (al corpo cellulare macchia), e la quarta immagine è Dapi (per nuclei macchia). Le immagini sono state raccolte in una Zeiss Axiovert 100. I campioni sono stati visualizzati con un Zeiss A-plan 10x Ph1 0.25 obiettivo NA e registrate con una fotocamera CoolSnapFX con 2 x 2 binning. I filtri sono stati i seguenti: 1.) A dicroico personalizzato beam splitter multipass ottimizzata per l'imaging DAPI, EGFP e TxRed (parte # BS51019 + 400dclp, Chroma Tecnologia, VT); 2.) Filtro-360 DAPI di eccitazione / 40 nm; 3.) Filtro-460 emissione DAPI / 50 nm; 4.) Filtro-470 EGFP di eccitazione / 40 nm; 5.) Filtro-525 emissione EGFP / 50 nm; 6.) Filtro-568 TxRed di eccitazione / 24 nm; 7.) TxRed emissione filtro-630/60 nm. Autofocus sul canale di colore TxRed stata eseguita in ogni posizione prima che la serie di immagini sono state raccolte. Protocollo: Le cellule sono state seminate su piatti TCPs a ~ 1000 cellule / pozzetto durante un ciclo di passaggio. Le colture sono state incubate overnight prova prima di essere risciacquato con PBS e poi fissati con 300 uM m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidyl estere (MBS) in tampone stabilizzante microtubuli (MTSB) composto da 4% (w / v) di polietilene glicole (PEG) 8000 , 100 mM di acido 1,4-piperazinediethanesulfonic (tubi), 10 mM etilene glicol-bis (2-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraacetico (EGTA), pH 6,9 per almeno 16h a RT. Il fissativo è stato rimosso e la soluzione di 0,05% Triton X100 in PBS contenente 10 ng / ml di Tx Red C2-maleimmide e 2 ng / ml DAPI per 2h. La soluzione colorante è stata rimossa, le cellule sono state lavate con PBS / BSA 3%, e 0,05% di sodio azide e PBS. Un 50% glicerolo / 10 mM Tris, pH 8,0 contenente 2 ng / ml DAPI e 0.9g / l 1,4-diazobiciclo [2,2,2] ottano (DABCO) come reagente antifade stata quindi aggiunta ad ogni pozzetto per scopi di imaging . Il fondo dei pozzetti sono stati puliti con etanolo al 70% e quindi pulire asciutto pulire prima di imaging. Scopo: Lo scopo del set di dati è stato quello di misurare la distribuzione di intensità di fluorescenza EGFP all'interno delle cellule individuali nella popolazione. Utilizzando i set di immagini raccolte, un plugin per ImageJ è stato utilizzato per eseguire le seguenti attività di analisi delle immagini. 1.) Le immagini Txred (che è una macchia generale corpo cellulare scopo) sono stati segmentati per soglia manuale. 2.) La maschera risultante è stato utilizzato per definire ROI cellulari sulle immagini DAPI e EGFP. 3.) Il numero di nuclei in ogni ROI è determinato dall'immagine DAPI e l'intensità integrata del segnale EGFP nella cella è determinata dalla ROI nell'immagine EGFP. 4.) Un'intensità sfondo locale intorno ogni cella nell'immagine EGFP è determinata dilatando il ROI da 3 pixel e determinare le intensità dei pixel nella sola zona dilatazione 3 pixel. Quando questo dati vengono inseriti in un foglio di calcolo, è possibile utilizzare i risultati per identificare gruppi di cellule (cioè hanno più di 1 nuclei), detriti o cellule parziale (cioè senza nuclei), povere misure EGFP / cellulari (cioè ad alta intensità di fondo). Il foglio può essere utilizzato per misurare la distribuzione di intensità di cellule EGFP all'interno di una popolazione di cellule. Le immagini di fase sono state raccolte come il controllo della qualità e la convalida dei dati. Le immagini di fase forniscono un meccanismo di convalida umana se ci sono domande circa la colorazione e / o il rilevamento della fluorescenza in un'immagine. Riferimenti: 1. Langenbach, KJ, Elliott, JT, Tona, A., e vegetali, altri (2006) Valutare la correlazione tra fibroblasti morfologia e l'attività del promotore su film sottili di proteine della matrice extracellulare. BMC-Biotecnologie 6 (1): 14. 2.Elliott, JT, Cavezza, M., Woodward, JT, Langenbach, KJ, Tona, A., Flora, AL (2008) Valutare la performance dei film di collagene fibrillari formate a superfici di polistirolo come substrato di coltura cellulare. Biointerphases. 3 (2): 19-28.Processo biologico: localizzazione, localizzazione cellulare, adesione cellulare.
Autore: John ElliotF
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