verfasst von Dr. Andreas Schallmoser (Klinik für gynäkologische Endokrinologie und Reproduktionsmedizin,Universitätsklinikum Bonn, Deutschland)
1. Einleitung
Die onkologische Behandlung junger Patientinnen ist häufig mit gonadotoxischen Nebenwirkungen verbunden, die zu irreversiblen Schädigungen führen können. Der Fertilitätserhalt durch Entnahme und Kryokonservierung von Ovargewebe stellt daher eine zentrale Option dar, um die reproduktive Kapazität nach Abschluss einer zytotoxischen Therapie wiederherzustellen (Baston-Büst et al. 2022, Lotz et al. 2022, Emrich et al. 2025). Während das Slow-Freezing seit vielen Jahren als Standardmethode etabliert ist, wird die Vitrifikation in der Kryobiologie als ernstzunehmende potenzielle Alternative bewertet. Bei der Vitrifikation verhindert die ultraschnelle Abkühlung die Bildung von Eiskristallen, die für zelluläre Schäden verantwortlich sind. Ziel dieses Fact Sheets ist es, den aktuellen wissenschaftlichen Kenntnisstand zur Vitrifikation im Vergleich zum Slow-Freezing von Ovargewebe zusammenzufassen und die klinische Evidenz bis 2025 zu bewerten.
2. Physikalische und biologische Grundlagen
Das Slow Freezing basiert auf einer kontrollierten, schrittweisen Absenkung der Temperatur mit etwa −0,3 bis −2 °C pro Minute. Publiziert sind eine Vielzahl von verschiedenen Slow-Freezing Protokollen mit unterschied-lichen Zusammensetzungen und Einwirkzeiten von Kryo-protektiva, die bis zu einem gewissen Grad dem Protokoll von Gosden folgen (Gosden et al. 1994). Diese Methode ermöglicht eine partielle Dehydrierung der Zellen und die Bildung einer extrazellulären Eiskristallstruktur. Trotz der kontrollierten Bedingungen besteht ein signifikantes Risiko für intrazelluläre Kristallbildung und osmotische Zellschäden, insbesondere in komplexen Gewebestrukturen wie dem Ovarcortex. Der Zeitaufwand beträgt etwa 2–3 Stunden. Demgegenüber nutzt die Vitrifikation eine ultraschnelle Abkühlungsrate bei gleichzeitig hohen Konzentrationen von Kryoprotektiva mit möglichst kurzen Einwirkzeiten. Die Übergangsphase von flüssig zu fest erfolgt ohne Eiskristallbildung, das Gewebe geht in einen amorphen Glaszustand über. Ziel ist die vollständige Unterdrückung der Eisnukleation, wodurch strukturelle und funktionelle Schäden minimiert werden.
3. Methodische Ansätze und Protokolle
Die Gewebeverarbeitung erfolgt unter GMP-konformen Bedingungen und unterliegt derzeit den Regularien des Arzneimittelgesetzes (§ 20b/c AMG). Vom Ovargewebe bleibt nach Entfernung der Medulla der ca. 1 mm dicke Cortex, welcher in Stücke geschnitten wird. Der Cortex enthält primordiale und primäre Follikel, aber auch größere Stadien die kryoprotektiv besonders empfindlich sind, die jedoch schneller zu einer MII Eizelle heranreifen können als Primordialfollikel (Schallmoser et al. 2022). Vor der Kryokonservierung werden die Gewebestücke schrittweise in Lösungen mit steigender Konzentration permeabler bzw. nicht permeabler Kryoprotektiva überführt. Zu den gebräuchlichen permeablen Kryoprotektiva zählen Ethylenglycol (EG), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Propandiol. Additive wie Sucrose, Trehalose, Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Serumproteine stabilisieren die Zellmembran und verhindern osmotische Schocks. Moderne Protokolle (Suzuki et al. 2015; Sänger et al. 2024) nutzen mehrstufige Equilibrierungsphasen mit kurzen Einwirkzeiten und metallbasierte Trägersysteme zur standardisierten Handhabung.
4. Vitalitätstests des Ovargewebes nach Kryokonservierung
Zur Bewertung der Vitalität von Ovargewebe vor/nach Kryokonservierung kommen fluoreszenzbasierte und farbstoffbasierte Assays zum Einsatz. Sie dienen der Qualitätssicherung und erlauben Rückschlüsse auf die funktionelle Erhaltung follikulärer Zellen nach dem Einfrieren und Auftauen.
Calcein-AM-Test:
Der Calcein-Assay basiert auf der intrazellulären Umwandlung des nichtfluoreszierenden Calcein-Acetoxymethylesters (Calcein-AM) durch Esterasen vitaler Zellen in das fluoreszierende Calcein. Nur metabolisch aktive Zellen emittieren dabei ein grünes Fluoreszenzsignal. Der Test wird in der Regel nach enzymatischer Dissoziation des Gewebes (z. B. Kollagenaseverdau) durchgeführt. Unter Fluoreszenzmikroskopie können vitale Follikel eindeutig identifiziert und quantifiziert werden.
Abbildung 1.: Vitale Follikel, die grünes Fluoreszenzlicht emittieren (495nm) (A-B) (Schallmoser et al. 2022).
Neutralrot-Test:
Der Neutralrot-Assay beruht auf der Fähigkeit vitaler Zellen, den schwach basischen Farbstoff Neutralrot in lysosomalen Vesikeln zu akkumulieren. Nach Inkubation wird überschüssiger Farbstoff ausgewaschen, und die Färbung vitaler Follikel erscheint rotorange unter Lichtmikroskopie. Dieser Test eignet sich besonders für die Beurteilung größerer Gewebeschnitte, da er ohne enzymatische Dissoziation auskommt.
Abbildung 2.: Neutralrotfärbung von Follikeln im Ovargewebe (Kristensen et al. 2018)
Bewertung:
Beide Verfahren korrelieren in der Regel eng miteinander und zeigen vergleichbare Ergebnisse bei der Untersuchung von Ovargewebe nach Slow-Freezing oder Vitrifikation. In Vergleichsstudien konnten keine signifikanten Unterschiede in der Vitalitätsrate festgestellt werden (Shi et al. 2017). Der Calcein-Test bietet eine höhere Sensitivität und eignet sich für detaillierte Zellanalysen, während der Neutralrot-Assay aufgrund seiner Einfachheit für Routinetests bevorzugt wird.
4. Ergebnisse und aktuelle Evidenzlage
Seit der Erstbeschreibung erfolgreicher Vitrifikationen von Ovargewebe (Suzuki et al. 2015) liegen weltweit sechs dokumentierte Lebendgeburten nach Retransplantation vor, darunter zwei in Japan, zwei in den USA und je eine in Deutschland und Schweden (Suzuki et al. 2015; Silber et al. 2018; Sänger et al. 2024; Keros et al. 2024). Im Vergleich zeigen In-vitro-Vitalitätstests keine signifikanten Unterschiede zwischen Slow Freezing und Vitrifikation. Systematische Reviews und Metaanalysen bestätigen diese Ergebnisse: Shi et al. (2017) berichteten von einer signifikant geringeren DNA-Strangbruchrate in vitrifiziertem Gewebe. Behl et al. (2022) fanden einen höheren Anteil intakter Stromazellen im Vergleich zum langsam eingefrorenen Gewebe. Dagegen zeigte die jüngste Metaanalyse von Kong et al. (2025) vergleichbare histologische und funktionelle Ergebnisse beider Verfahren, wobei die Autoren betonten, dass die Zahl klinischer Anwendungen der Vitrifikation bislang noch gering sei. Bei der Anwendung von vitrifikationsspezifischen rapid warming Protokollen die auch zum Auftau langsam eingefrorener Proben angewendet werden können weisen TUNEL-Assays auf eine geringere Apoptoserate nach 'rapid warming' hin, was auf reduzierte thermische und mechanische Zellschäden hindeutet (Färber et al. 2025). Wie auch beim Slow-Freezing existieren verschiedene Vitrifikations Protokolle mit unterschiedlicher Zusammensetzung und Kombinationen von Kryoprotektiva und Einwirkzeiten (Leonel et al. 2019).
5. Technische und klinische Bewertung
Die Vitrifikation bietet aus physikalischer Sicht klare Vorteile hinsichtlich Eiskristallfreiheit und Zeitersparnis. Im Vergleich zeigt das Slow-Freezing längere Prozessdauer und potenzielle Eisbildung. Klinisch ist die Wiederherstellung der endokrinen Funktion nach Retransplantation beider Verfahren möglich, die Datenlage zur Fertilitätswiederherstellung nach Vitrifikation jedoch noch begrenzt. Die ESHRE-Guideline (Anderson et al. 2020) klassifiziert Slow-Freezing weiterhin als Standardverfahren für Ovargewebe, bezeichnet die Vitrifikation jedoch als „promising technique supported by technical aspects“. Nur ein geringer Anteil der verarbeitenden Zentren nutzt derzeit Vitrifikation. Zunehmende Standardisierung und CE-zertifizierte Systeme (z. B. Kitazato) erleichtern die Implementierung in die klinische Routine.
6. Diskussion und Ausblick
Die zunehmende Evidenzlage deutet darauf hin, dass die Vitrifikation eine gleichwertige oder überlegene Alternative zum Slow Freezing darstellen könnte, insbesondere im Hinblick auf die Erhaltung der stromalen Integrität und die Vermeidung von Eiskristallbildung. Dabei ist zu berücksichtigen, dass das Slow Freezing eine Vielzahl unterschiedlicher Protokolle umfasst und die bislang höhere Zahl an Geburten vor allem auf die langjährige und weit verbreitete Anwendung dieser Methode zurückzuführen ist. Der wissenschaftliche Fortschritt in diesem Bereich verläuft jedoch nur langsam, da zwischen Kryokonservierung und Transplantation häufig viele Jahre liegen. Aktuelle Forschungsarbeiten fokussieren auf die Optimierung der Kryoprotektivakombinationen, die Entwicklung von universellen Auftauprotokollen (Färber et al. 2025) und die Implementierung automatisierter Kühlsysteme.
7. Literaturverzeichnis
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Stand: Oktober 2025
