Für einige Coronaviren, die ein nicht gespaltenes Spike-Protein auf ihrer Oberfläche enthalten, wie MHV-2 und SARS-CoV, wurde gezeigt, dass sie für den produktiven Eintritt auf endosomale Proteasen angewiesen sind. In der Tat hängt der MHV-2-Eintrag vom Cathepsin L und B der Wirtszelle ab. Diese Abhängigkeit wird durch die Einführung einer Furin-Spaltstelle zwischen den S1- und S2-Domänen aufgehoben. Bei SARS-CoV ist der Zusammenhang zwischen Spaltung und Fusion komplexer. Es wurde gezeigt, dass die SARS-CoV-Infektion durch lysomotrope Mittel aufgrund der Hemmung der Protease Cathepsin L mit niedrigem pH-Wert gehemmt wird. Zusätzlich kann die Zell-Zell- und Virus-Zell-Fusion durch Trypsin-Behandlung ausgelöst werden. Dies führte zu der Hypothese, dass die SARS-CoV-Fusion durch proteolytische Prozessierung des Spike-Proteins ausgelöst wurde. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Proteasen die SARS-CoV-Infektion in vitro verstärken: Trypsin, Thermolysin und Elastase. Die Analyse der Verarbeitung von SARS-CoV-Spike-Proteinen durch Trypsin und Elastase hatte Aufschluss über die SARS-CoV-Fusion gegeben. Es wurde gezeigt, dass Trypsin die Fusion durch sequentielle Spaltung des Spike-Proteins an zwei diskreten Stellen aktiviert. Das erste Spaltungsereignis an der S1-S2-Grenze (R667) erleichtert wahrscheinlich das zweite Spaltungsereignis an der Position R797 (S2'-Region), die für die Fusionsaktivierung verantwortlich ist. Die zweite Spaltung erfolgt direkt am N-terminalen Ende des Fusionspeptids. Die Spaltung bei R667 ist für die Fusionsaktivierung entbehrlich, verstärkt jedoch die Zell-Zell- oder Virus-Zell-Fusion. Elastase vermittelt die Spaltung am Rest T795, nicht direkt neben dem Fusionspeptid. Das SARS-CoV-Spike-Protein zeigt einen gewissen Grad an Plastizität an der Position der Spaltstelle für das Priming der Fusion. Wenn umgekehrt Influenza-HA durch Pseudomonas-Elastase gespalten wird, wird die Spaltposition um eine Aminosäure verschoben, was zu einer Inkompetenz der Fusion führt. Der SARS-CoV S-Rest 795 ist für die Spaltung wahrscheinlich weniger zugänglich als der Rest 797, und die durch die Spaltung an Position 797 induzierte Fusion ist effizienter. Der Unterschied der Fusionswirksamkeit kann auch aus seiner Position am N-Terminus des Fusionspeptids resultieren. Diese Daten legen nahe, dass die Fusion durch räumliche Regulation der Spaltstelle moduliert wird. Es wurde gezeigt, dass Cathepsin L das SARS-CoV-Spike-Protein in der S1-S2-Grenzregion am Rest T678 spaltet. Die Spaltung in der S2'-Region muss jedoch noch endgültig nachgewiesen werden.SARS-CoV kann in Gegenwart einer relevanten exogenen Protease direkt an der Zelloberfläche fusionieren. Es wird angenommen, dass dieser Eintrittsweg 100- bis 1000-fach effizienter ist als der endosomale Weg. Die Verfügbarkeit von Proteasen im extrazellulären Milieu ist ein Schlüsselfaktor für Tropismus. SARS-CoV ist ein Erreger der Atemwege und es ist seit langem bekannt, dass Proteasen aus den Atemwegen wie Mitglieder der Transmembranprotease / Serin-Unterfamilie (TMPRSS), TMPRSS2 oder HAT (TMPRSS11d) Influenza-HA spalten können. Tatsächlich können sowohl TMPRSS2 als auch HAT (oder TMPRSS11d) die SARS-CoV-Fusion induzieren. Die Infektion von Zielzellen mit SARS-CoV S-pseudotypisierten Virionen ist weniger empfindlich gegenüber Cathepsin-Inhibitoren, wenn Zielzellen TMPRSS2 exprimieren. SARS-CoV S-pseudotypisierte Virionen, die in Zellen produziert werden, die TMPRSS2 exprimieren, sind für den Eintritt immer noch auf endosomales Cathepsin angewiesen, während sie weniger empfindlich gegenüber neutralisierenden Antikörpern sind. Dieser Effekt wurde auf die Freisetzung von Spike-Fragmenten im Überstand zurückgeführt, die Antikörper anlocken und für die Ausbreitung des Virus von großer Bedeutung sein können. Es wurde gezeigt, dass die Verarbeitung des Spike-Proteins durch HAT und TMPRSS2 unterschiedlich sein kann: HAT spaltet das SARS-CoV S-Protein hauptsächlich bei R667, während TMPRSS2 das Protein an mehreren Stellen spaltet, insbesondere in einer Region nahe S2 ', obwohl die genauen Stellen von Die Spaltstellen für diese Protease müssen noch bestimmt werden. Die Expression von HAT in Zielzellen verleiht dem Eintritt von SARS-CoV S-pseudotypisierten Virionen keine Resistenz gegen NH4Cl oder Cathepsin-Inhibitor. Es ist wahrscheinlich, dass die räumliche und zeitliche Modulation der Aktivierung durch Proteasen eine wichtige Rolle spielt. Die Spaltung eingehender Virionen vor ihrer Bindung an die Zelle würde die Infektion wahrscheinlich durch Inaktivierung des Virions abbrechen. Interessanterweise ist TMPRSS2 mit ACE2, dem SARS-CoV-Rezeptor, assoziiert. TMPRSS2 spielt wahrscheinlich eine Schlüsselrolle bei der Erstinfektion und Ausbreitung des Virus. Die Bedeutung dieser Protease für die SARS-CoV-Infektion ergibt sich jedoch aus einem feinen Gleichgewicht zwischen zwei Antagonisteneffekten auf die Infektion: Abgabe des Rezeptors und Fusionsaktivierung.Für FCoV stammt ein gut untersuchter Fall für die Rolle der proteolytischen Aktivierung von Spikes aus der Forschung am Typ-2-FCoV-Paar FECV 79–1683 und FIPV 79–1146. Durch die Verwendung spezifischer Cathepsin-Inhibitoren haben die Autoren gezeigt, dass sich die beiden Stämme in ihrer Verwendung von aktivierenden Proteasen, die während des Eintritts verwendet werden, erheblich unterscheiden. Während festgestellt wurde, dass der FECV-Stamm 79–1683 sowohl auf Cathepsin B und L als auch auf einer sauren endosomalen Umgebung beruht, war der FIPV-Stamm 79–1146 nur von der Cathepsin B-Aktivität abhängig. Dies wurde weiter durch einen biochemischen Assay bestätigt, der ergab, dass FECV 79–1683 durch Cathepsin B und L gespalten werden kann, während FIPV 79–1146 nur durch Cathepsin B gespalten werden konnte. Basierend auf den Molekulargewichten der Cathepsin-Spaltprodukte war dies der Fall Hypothese, dass sich die Spaltstelle nicht in der Grenzregion zwischen der S1- und S2-Domäne befand, sondern in einer Region im C-terminalen Teil von S2Ein kritisches Merkmal eines viralen Fusionsproteins ist das sogenannte „Fusionspeptid“, eine relativ unpolare Region mit 15 bis 25 Aminosäuren, die mit Membranen interagiert und eine wesentliche Rolle bei der Fusionsreaktion spielt. Fusionspeptide von viralen Fusionsproteinen der Klasse I werden in Abhängigkeit von ihrer Position relativ zur proteolytischen Spaltstelle typischerweise als "extern" oder "intern" klassifiziert. Ein Schlüsselmerkmal von viralen Fusionspeptiden ist, dass innerhalb einer bestimmten Virusfamilie eine hohe Konservierung von Aminosäureresten vorliegt; Es gibt jedoch wenig Ähnlichkeit zwischen Fusionspeptiden verschiedener Virusfamilien. Im Fall der Influenza HA, die ein klassisches Beispiel für ein "externes" Fusionspeptid ist, dringen die N- und C-terminalen Teile des Fusionspeptids (die α-helikal sind) mit a in die äußere Packungsbeilage der Zielmembran ein Knick an der Phospholipidoberfläche. Das Innere des Knicks enthält hydrophobe Aminosäuren mit geladenen Rückständen auf der Außenseite. Interne Fusionspeptide (wie das im Ebola-Virus GP gefundene) bestehen häufig aus Schleifen, erfordern jedoch auch eine Mischung aus hydrophoben und flexiblen Resten ähnlich wie N-terminale Fusionspeptide. Es ist wichtig zu beachten, dass virale Fusionspeptide trotz des Vorhandenseins wichtiger hydrophober Reste häufig keine ausgedehnten Hydrophobizitätsabschnitte aufweisen und einen oder mehrere geladene Reste enthalten können.Bisher ist der genaue Ort und die genaue Sequenz des Coronavirus-Fusionspeptids nicht bekannt. In Analogie zu anderen viralen Fusionsproteinen der Klasse I wird jedoch vorausgesagt, dass es sich in der S2-Domäne befindet. Der Ort des Fusionspeptids wurde am ausführlichsten auf SARS-CoV untersucht. Drei membranotrope Regionen in SARS-CoV S2 wurden ursprünglich als potenzielle Fusionspeptide vorgeschlagen. Basierend auf einer Sequenzanalyse und einer Hydrophobizitätsanalyse des S-Proteins unter Verwendung der hydrophoben Grenzflächenskala der Wimley-White (WW) -Schnittstelle waren erste Hinweise darauf, dass sich das SARS-CoV-Fusionspeptid im N-terminalen Teil von HR1 befand. welches über die Coronaviridae konserviert ist. Die Mutagenese dieses vorhergesagten Fusionspeptids inhibierte die Fusion in Syncytia-Assays von S-exprimierenden Zellen. Diese Region von SARS-CoV wurde auch von anderen Gruppen in biochemischen Assays analysiert und als Region des Zweiten Weltkriegs (Reste 864–886) definiert - obwohl Sainz et al. identifizierten tatsächlich eine andere, weniger konservierte und weniger hydrophobe Region (WW I, Reste 770–778) als am wichtigsten für die Fusion. Peptide, die dieser Region entsprechen, wurden auch in biochemischen Tests von anderen Gruppen untersucht. Zusätzlich wurde gezeigt, dass eine dritte aromatische Region neben der Transmembrandomäne (die membranproximale Domäne) bei der SARS-CoV-Fusion wichtig ist. Diese membranproximale Domäne wirkt wahrscheinlich zusammen mit einem Fusionspeptid in der S2-Ektodomäne, um die endgültige Doppelschichtfusion zu vermitteln, sobald Konformationsänderungen das Fusionspeptid in der Ektodomäne freigelegt haben.Basierend auf dem Befund, dass SARS-CoV S an einer stromabwärts gelegenen Position in S2 am Rest 797 proteolytisch gespalten werden kann, wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob die Spaltung an dieser internen Position in S2 eine Domäne freilegen könnte mit Eigenschaften eines viralen Fusionspeptids. Eine Mutagenesestudie der SARS-CoV S-Reste 798–815, einer Strecke zwischen den Regionen des Ersten und Zweiten Weltkriegs, kombiniert mit Lipidmischungs- und Strukturstudien eines isolierten Peptids, zeigte die Bedeutung dieser Region als neues Fusionspeptid für SARS-CoV. Die Sequenz, die unmittelbar C-terminal zur R797-Spaltstelle von SARS-CoV S ist, ist SFIEDLLFNKVTLADAGF, und es ist bemerkenswert, dass sowohl R797 als auch diese nachgeschaltete Sequenz über die Coronaviridae hinweg hoch konserviert sind. Insbesondere das IEDLLF-Motiv zeigte nur minimale Divergenz mit gelegentlichen konservativen Substitutionen.Die Untersuchung des vorgeschlagenen IEDLLF-Fusionspeptids im Kontext eines Strukturmodells des SARS-CoV S-Homotrimers zeigt, dass es extern in der Mitte des Trimers positioniert ist und als solches geeignet zu sein scheint, um als Fusionspeptid zu fungieren. Insbesondere sind L803, L804 und F805 die Ausgangsreste einer wichtigen antigenen Determinante von SARS-CoV S (Leu 803 - Ala 828), die neutralisierende Antikörper induzieren kann. Dieses SARS-CoV-Epitop ist auch homolog zu einer immundominanten neutralisierenden Domäne (dem 5B19-Epitop) auf der MHV S2-Untereinheit . Während eine Kristallstruktur der SARS-CoV-S-Ektodomäne noch nicht gelöst ist, ist ein Vorhersagemodell der quaternären Struktur verfügbar: PDB-Eintrag 1T7G. Im Kontext dieses Modells ist das neue S2-Fusionspeptid hauptsächlich helikal (insbesondere die konservierten Reste SxIEDLLF) mit einer kurzen zentralen unstrukturierten Region und befindet sich in einer relativ exponierten Position auf halber Höhe des trimeren Spike-Proteinkomplexes. Diese Struktur und Position innerhalb des S-Trimers stimmt mit seiner Funktion als virales Fusionspeptid überein. Vergleiche mit anderen Fusionsproteinen zeigen einige Ähnlichkeiten mit den "internen" Fusionspeptiden des Ebola-Virus und des Vogel-Leukose-Virus. Wie diese Viren wird das Coronavirus-Fusionspeptid durch proteolytische Spaltung exponiert, ist jedoch kein klassisches „externes“ Fusionspeptid wie Influenza HA.Schlussfolgerung Jahr 2013 Quelle ncbi.nlm.nih.govIn den letzten zehn Jahren wurden viele neue Coronaviren identifiziert. Sie infizieren eine Vielzahl von Wirten, von Säugetieren bis zu Vögeln. Eng entfernte Coronaviren wurden bei entfernt verwandten Tieren identifiziert, was auf kürzliche Interspeziesprünge hindeutet. Die Coronavirus-Diversität beruht im Wesentlichen auf der geringen Wiedergabetreue der viral codierten RNA-abhängigen RNA-Polymerase, die pro Stelle und Jahr etwa 10-3 bis 10-5 Substitutionen erzeugt. Die große Größe und Replikationsstrategie des Coronavirus-Genoms ermöglicht auch eine häufige homologe Rekombination, ein Prozess, der den Austausch von genetischem Material während einer Koinfektion ermöglicht. Eine anhaltende Infektion führt zur Akkumulation adaptiver Mutationen. Die Folgen des Barrierenspringens von Coronavirus-Arten können verheerend sein und zu schweren Krankheiten und Sterblichkeit führen, wie beispielsweise der SARS-Ausbruch zeigt. Das Spike-Protein ist die Hauptdeterminante für den Tropismus von Coronaviren. Eine Modifikation der Spitze kann den Zell- und Gewebetropismus verändern und in einigen Fällen in Verbindung mit anderen Virus- und Wirtsfaktoren zu einer Veränderung der Viruspathogenität führen. Zoonosen stellen ein echtes Risiko für die menschliche Gesundheit dar. In der Vergangenheit haben Coronaviren häufig gezeigt, dass sie dazu neigen, neue Wirte zu infizieren, was die Fähigkeit zur Virusentwicklung und die Notwendigkeit einer Überwachung hervorhebt. Beim Verständnis der Spike-Protein-Funktionen wurden große Fortschritte erzielt. Es ist jedoch weiterhin unmöglich, die Auswirkungen von Mutationen vorherzusagen, die ein Virus möglicherweise erhält. Quelle ist ncbi.nlm.nih.gov aus dem englischen- Verfasser bitte im O-Text