HCoV-229E, TGEV, Serotyp 2 FCoV und CCoV verwenden alle das Aminopeptidase N (APN) -Protein ihres natürlichen Wirts als Rezeptor. Interessanterweise können diese Viren zusätzlich zu ihrem spezifischen Wirts-APN den Katzen-APN binden. Es wurde vermutet, dass diese Viren von einem gemeinsamen Vorfahren-Coronavirus stammen, das Katzen infiziert, die APN als Rezeptor verwendeten. APN, auch bekannt als CD13, ist ein Typ-II-Transmembranprotein, das in der apikalen Domäne von Epithelzellen der Atemwege und des Darmtrakts exprimiert wird. APN ist eine Zn2 + -abhängige Protease, die Peptide oder Proteine mit einer N-terminalen neutralen Aminosäure bevorzugt abbaut. Es wurde gezeigt, dass Tropismusunterschiede dieser Viren auf die Fähigkeit ihrer Spike-Proteine zurückzuführen sind, kleine speziesspezifische Aminosäureunterschiede in APN zu erkennen. Spike-Proteine von HCoV-229E, TGEV, FCoV und CCoV weisen eine hohe Homologie auf, Bindungsdomänen befinden sich jedoch in nicht homologen Regionen.TGEV infiziert Epithelzellen aus dem Dünndarm, kann aber auch Zellen aus den Atemwegen infizieren. Mitte der 1980er Jahre wurde in Belgien eine abgeschwächte Variante von TGEV, dem respiratorischen Coronavirus (PRCoV) von Schweinen, isoliert. Dieses Virus liefert ein Beispiel für einen veränderten Gewebetropismus aufgrund einer Deletion im Spike-Gen. Im Gegensatz zu TGEV infiziert PRCoV nur Lungenepithelzellen. Beide Spike-Proteine binden Schweine-APN, wobei sich die Rezeptorbindungsdomäne zwischen den Resten 522 und 744 des TGEV S-Proteins befindet. Das Spike-Protein von TGEV weist eine Hämagglutinierungsaktivität auf, die in PRCoV fehlt, da diese Aktivität im deletierten N-terminalen Teil des Proteins enthalten ist. Eine der Folgen dieses Mangels an Aktivität ist die Unfähigkeit von PRCoV, sich im Darm zu replizieren. Die hämagglutinierende Aktivität wurde auf die Reste 145–155 des TGEV-Spike-Proteins abgebildet, und es wurde gezeigt, dass eine Mutation, die diese Aktivität aufhebt, die Enteropathogenität des Virus verringert. Darüber hinaus hat eine Studie gezeigt, dass die Sialinsäurebindungsaktivität von TGEV für die Bindung eines zusätzlichen Proteins verantwortlich ist, das als Mucin-ähnliches Glykoprotein (MPG) in Bürstensaummembranen bezeichnet wird. Es wurde vermutet, dass diese Bindung das Virus vor der Wirkung von Darmemulgatoren schützen könnte. Die Rolle der NTD- und Kohlenhydratbindung bei TGEV liefert interessante Einblicke in den Coronavirus-Enterotropismus, eine Eigenschaft, die im Allgemeinen nicht umhüllten Viren zugeschrieben wird. Die Rolle der NTD bei anderen enterischen Alphacoronaviren wie FCoV und Canine Coronavirus (CCoV) ist noch unbekannt.Andere Coronaviren weisen eine Sialinsäurebindungsaktivität auf, insbesondere das Rinder-Coronavirus (BCoV) und das humane HCoV-OC43. Die Fähigkeit von Betacoronaviren, Kohlenhydrate zu binden, wurde auf eine Galectin-faltenartige Struktur im S1 NTD abgebildet. Bisher wurden außer der Bindung von Neu5,9Ac2-Konjugaten keine weiteren spezifischen Rezeptoren für diese Viren identifiziert. Sie gehören zur Betacoronavirus-Gruppe und enthalten HE-Proteine. Sie ähneln daher dem Influenzavirus, da sie ein rezeptorzerstörendes Enzym aufweisen. Die genaue Rolle von HE beim Eintritt in das Coronavirus bleibt jedoch unklar. IBV zeigt auch Sialinsäurebindungsaktivität, aber die Rolle dieser Aktivität bei der Pathogenität ist nicht bekannt. Für IBV wurde ein erweiterter Wirtsbereich von Beaudette-Stämmen in der Zellkultur mit dem Vorhandensein einer Heparin-Bindungsstelle im Spike-Protein in Verbindung gebracht.Ein weiteres Beispiel für die Heparansulfatbindung (Heparansulfat gehört zur Gruppe der Glykosaminoglykane, die aus langen Ketten von Disaccharid-Bausteinen bestehen, sowie zur Gruppe der Heparine. Die Disaccharide der Heparinsulfate bestehen aus D-Glucosamin-Einheiten kombiniert mit D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure, wobei R¹, R³ = SO₃H/H R² = SO₃H/Ac)ist die FCoV-Spitze vom Typ 1. Durch Inkubation von Viren mit Heparin-Agarose-Kügelchen (Heparin hat eine sehr ähnliche Struktur wie Heparansulfat und wird in Bindungsassays verwendet) haben de Haan und Kollegen durch Quantifizierung von Kügelchen-assoziierter viraler RNA gezeigt, dass das zellkulturadaptierte Typ-1-FIPV. Der UCD1-Stamm kann Heparin binden. Sehr interessanterweise befindet sich das von den Autoren vorgeschlagene mutmaßliche Heparin-Bindungsmotiv an einer defekten Furin-Spaltstelle an der Grenze zwischen den S1- und S2-Domänen. Das Typ-2-FIPV 79–1146 sowie das UCD1-verwandte Typ-1-FIPV-UCD, das eine funktionelle Furinspaltungsstelle enthält, konnten die Heparinkügelchen nicht binden. Dies stützt die Annahme, dass ein ungespaltenes Heparansulfat-Erkennungsmotiv für die Bindungsaktivität erforderlich ist. Darüber hinaus fanden die Autoren heraus, dass die Inokulation von UCD1 in FCWF-Zellen in Gegenwart von konkurrierendem Heparin die Infektion stark verringerte. Die Infektion mit Typ 2 FIPV 79–1146 war von diesem Heparin-Kompetitionsassay nicht betroffen.Wie oben erwähnt, ist die Coronavirus-Spike-Protein / Rezeptor-Paarung eine Schlüsseldeterminante für Tropismus. Um eine neue Wirtsspezies zu infizieren, müssen sich Coronaviren entweder durch Mutation oder durch Rekombination mit einem Coronavirus, das ihren neuen Wirt infiziert, an den Rezeptor ihres neuen Wirts anpassen. Im Fall von SARS-CoV trat das Virus 2002 auf den Einzelhandelsmärkten für lebende Tiere in China auf. Verwandte Viren wurden aus Himalaya-Palmenzibeten, Waschbärhunden und chinesischen Frettchen isoliert; Es wird jedoch angenommen, dass diese Tiere nicht das Reservoir des Virus waren, sondern Zwischenwirte während des Artensprungereignisses. Der Rezeptor des SARS-CoV ist das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2). ACE2 ist ein integrales Membranprotein vom Typ I, das reichlich im Lungengewebe exprimiert wird. Es ist eine Monocarboxypeptidase, die Angiotensin II hydrolysiert. Humane und Himalaya-Palm-Civet-Coronavirus-Rezeptor-Verwendungsanalysen haben gezeigt, dass menschliches SARS-CoV sowohl menschliches als auch Palm-Civet-ACE2 binden kann, während das Palm-Civet-Virus hACE2 nicht binden kann. Es wurde gezeigt, dass die Anpassung des Virus an den Menschen auf zwei Punktmutationen, K479N und S487T, in der Bindungsdomäne des SARS-CoV S-Proteins zurückzuführen ist. Weitere Charakterisierung von Wu et al. von adaptiven Mutationen der RBD führten zur Identifizierung von Mutationen, die die Interaktion mit menschlichem oder Palmzibet ACE2 verstärken. SARS-CoV-ähnliche Viren wurden in Fledermäusen isoliert. In diesem Fall erfolgt der Eintritt nicht über ACE2 und ihre Rezeptoren sind unbekannt; Der Ersatz der Aminosäuresequenz zwischen den Resten 323 und 505 durch die entsprechende Sequenz der SARS-CoV-RBD reicht jedoch aus, um die Verwendung des menschlichen ACE2-Rezeptors zu ermöglichen.Coronaviren können viele Zelloberflächenmoleküle - Proteine und Kohlenhydrate gleichermaßen - nutzen, um Zugang zu Zielzellen zu erhalten. Es wurde erkannt, dass Calcium-abhängige (C-Typ) Lektine des Wirts eine Rolle bei der Infektion durch SARS-CoV, IBV und FCoV spielen. Dendritisches zellspezifisches interzelluläres Adhäsionsmolekül-3-greifendes Nicht-Integrin (DC-SIGN) ist ein C-Typ-Lektin, das auf Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird. Seine Funktion besteht darin, Glykosylierungsmuster mit hohem Mannosegehalt zu erkennen, die häufig bei viralen und bakteriellen Krankheitserregern auftreten. Die virale Ausbeutung von DC-SIGN ist am besten in HIV-1 dokumentiert, das über N-glykosylierte Reste an der Oberfläche des Virus bindet. HIV-1 verwendet DC-SIGN, um die Immunabwehr des Wirts zu untergraben, indem es direkt (in-cis) in eine Infektion von dendritischen Zellen oder Makrophagen eintritt und diese initiiert oder mit der Zelle zu Lymphknoten reist, wo das Virus auf T-Zellen übertragen wird immunologische Synapse (in-trans). Wie HIV-1 gp120 ist der Coronavirus-Spike stark glykosyliert, wodurch das Virus die Möglichkeit erhält, mit Wirtslektinen wie DC / L-SIGN zu interagieren. Es wurde berichtet, dass L-SIGN, das sowohl in Endothelzellen der Leber als auch in der Lunge exprimiert wird, ein alternativer Rezeptor für SARS-CoV und HCoV-229E ist. Die In-Trans-Übertragung von SARS-CoV durch dendritische Zellen auf anfällige Zielzellen wurde dokumentiert. Obwohl die untersuchten dendritischen Zellen in der Lage waren, infektiöse Virionen über eine synapsenartige Struktur zu übertragen, wurde keine In-cis-Infektion beobachtet. Die ortsgerichtete Mutagenese hat die Glykosylierung an den Asparaginresten 109, 118, 119, 158, 227, 589 und 699 als kritisch für den L-SIGN / DC-SIGN-vermittelten Eintritt identifiziert.FIPV ist ein Beispiel für ein Coronavirus, das auf Immunzellen - insbesondere Monozyten und Makrophagen - abzielt, um eine systemische Ausbreitung zu erreichen. Die Infektion nicht permissiver Zelltypen wurde durch exogene Expression von DC-SIGN erreicht, was zeigt, dass sowohl FIPVs vom Typ 1 als auch vom Typ 2 DC-SIGN als Co-Rezeptor bzw. als alternativen Rezeptor zu fAPN verwenden. Im Fall von IBV haben Experimente gezeigt, dass DC-SIGN und das eng verwandte L-SIGN die Infektion von ansonsten nicht permissiven Zellen auf sialinsäureunabhängige Weise verstärken. Die Rolle von Lektinen bei der IBV-Infektion in vivo ist unbestimmt.Eintritt des Virus und Verschmelzung über BindungsproteineDer Eintritt von umhüllten Viren kann direkt an der Zelloberfläche nach Bindung an den Rezeptor oder nach Internalisierung über Endozytose erfolgen, wobei die Fusion im endosomalen Kompartiment stattfindet. Die Fusion von viralen Membranen mit Wirtsmembranen wird durch große Konformationsänderungen des Spike-Proteins angetrieben. Im Laufe der Zeit haben Coronaviren ihre Spike-Proteine modifiziert, was zu einer Vielzahl von Triggern führte, die zur Aktivierung ihrer Fusion verwendet wurden. Diese Konformationsänderungen können durch Rezeptorbindung ausgelöst werden, erfordern jedoch möglicherweise zusätzliche Auslöser wie pH-Ansäuerung oder proteolytische Aktivierung. Die Mechanismen des Coronavirus-Eintritts sind komplex und unterscheiden sich zwischen Coronavirus-Arten und -Stämmen. Beispielsweise kann abhängig vom MHV-Stamm die Fusion direkt an der Zelloberfläche nach der Rezeptorbindung oder nach der Endozytose erfolgen. Der JHM-Stamm MHV-4 fusioniert bei neutralem pH-Wert, das Virus wurde jedoch auch in endosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es ist wahrscheinlich, dass MHV-4 direkt an der Zelloberfläche oder über den endosomalen Weg eintreten kann. Die Wahl des Eingabemechanismus kann vom Zelltyp abhängen. In beiden Fällen wird die Fusion ausschließlich durch Rezeptorbindung ausgelöst. In der Tat wurde gezeigt, dass die Inkubation von JHM-Spike-Protein mit einer löslichen Form des Rezeptors CEACAM1 Modifikationen der S-Hydrophobizität und Konformationsänderung der S2-Region induziert. Darüber hinaus kann sich JHM von DBT-Zellen auf BHK-Zellen ausbreiten, die den MHV-Rezeptor nicht exprimieren. Die Inkubation mit löslichem Rezeptor erhöht diese rezeptorunabhängige Vermehrung. Die Fähigkeit des Spike-Proteins, bei neutralem pH zu fusionieren, hängt von den Eigenschaften der Fusionsmaschinerie ab. Eine Variante von MHV-4, die aus persistent infizierten Zellen isoliert wurde, erfordert eine niedrige pH-Exposition für eine produktive Infektion. Der Unterschied des pH-Bedarfs für die Fusion zwischen der Mutante und dem Wildtyp-Virus wurde auf Dreipunktmutationen in den Heptad-Repeat-Regionen zurückgeführt. In Bezug auf MHV-A59-Eintrittsmechanismen wurden widersprüchliche Ergebnisse berichtet. Qui et al. berichteten, dass der Elternstamm von MHV-A59 unempfindlich gegenüber lysomotropem Mittel war, während der rekombinante Stamm, der das MHV-2-Spike-Protein enthielt, für den Eintritt auf einen niedrigen pH-Wert angewiesen ist. In der Tat erfordert der Eintritt von MHV-2 endosomale Proteasen mit niedrigem pH-Wert (Cathepsin B und L), und wenn eine Spaltstelle in das MHV-2-Spike-Protein eingeführt wird, erfordert der Viruseintritt diese Proteasen nicht mehr. Diese Daten sprechen für eine pH-unabhängige Fusion, die durch Rezeptorbindung induziert wird. Eifart et al. forderte dieses Szenario heraus. In Kombination verschiedener Infektions- und Mikroskopieansätze haben die Autoren gezeigt, dass die MHV-A59-Infektion empfindlich auf lysomotrope Mittel reagiert und dass das Virus internalisiert wird, was die Einleitung einer Infektion ermöglicht, was darauf hindeutet, dass eine pH-Ansäuerung erforderlich ist, um die Virusfusion auszulösen. Es ist wahrscheinlich, dass die Rezeptorbindung eine Schlüsseldeterminante für den MHV-Eintritt ist, jedoch bleibt die Notwendigkeit eines zusätzlichen Fusionsauslösers unklar. Für MHV-2 wurde der Endozytosemechanismus weiter charakterisiert: Das Virus wird über einen Clathrin-abhängigen Weg internalisiert, der nicht vom eps15-Adapter abhängt.Die Ansäuerung des endosomalen pH-Werts ist ein Fusionsauslöser für viele Viren wie das Influenzavirus und das vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV). Viele Jahre lang wurde angenommen, dass die IBV-Fusion bei neutralem pH-Wert stattfindet, da infizierte Zellen bei neutralem pH-Wert große Synzytien bilden. Es wurde jedoch von Chu et al. Diese Infektion wird durch ein lysomotropes Mittel blockiert und der IBV-Fusionsprozess wurde durch einen niedrigen pH-Wert aktiviert. Die Autoren bewerteten direkt die pH-Abhängigkeit der IBV-Fusion in Fluoreszenzlöschungsassays. Sie zeigten, dass die Fusion bei saurem pH erfolgt, wobei eine halbmaximale Fusionsrate bei pH 5,5 auftritt. Um Zellen zu infizieren, tritt IBV durch Endozytose ein. Inhibitorische Medikamente des Clathrin-vermittelten Weges wie Chlorpromazin hoben auch die IBV-Infektion auf. IBV-Virionen enthalten gespaltene Spike-Proteine, wobei die Spaltung zwischen den S1- und S2-Domänen erfolgt. Der IBV-Beaudette-Stamm hat das besondere Merkmal, eine zweite Furin-Spaltstelle in der S2-Domäne der Spitze zu enthalten. Die Infektion und Synzytienbildung wird durch die Anwesenheit eines Furininhibitors gehemmt. Die Mutation oder Deletion der S1-S2-Spaltstelle im Beaudette-Spike-Protein verzögert die Virusvermehrung, hebt jedoch die Synzytienbildung nicht auf. Diese Mutanten sind immer noch empfindlich gegenüber Furinhemmung. Mutanten mit einer minimalen Spaltstelle XXXR690 / S sind infektiös, hängen jedoch für eine produktive Infektion von Serinproteasen ab.
Die Beziehung zwischen der Spaltbarkeit des Coronavirus-Spike-Proteins und seiner Fusogenität ist seit vielen Jahren eine Diskussionsquelle für Forscher. Wenn virale Fusionsproteine an der Zelloberfläche exprimiert werden, führt die Aktivierung der viralen Fusion zur Zell-Zell-Fusion und zur Bildung von riesigen mehrkernigen Zellen, die als Synzytien bezeichnet werden. Es wird allgemein angenommen, dass die Bildung von Synzytien, bei der Zellmembranen miteinander verschmelzen, den Fusionsprozess zwischen viralen und Wirtszellmembranen widerspiegelt. Es scheint jedoch, dass sich die Zell-Zell- und Virus-Zell-Fusionsmechanismen unterscheiden können. In der Tat können sich die Prozesse, die an der Zell-Zell- und Virus-Zell-Fusion beteiligt sind, aufgrund von Unterschieden in Faktoren wie Membrankrümmung und / oder Dichte von Glykoproteinen der Virushülle mechanistisch erheblich unterscheiden. Darüber hinaus wird die Bildung von Synzytien in infizierten Zellen nicht bei allen Coronaviren beobachtet. Die Spaltung des Fusionsproteins ist ein gemeinsames Merkmal von viralen Fusionsproteinen der Klasse I. Für die Influenza ist die Art der Spaltstelle von HA für die Pathogenität des Virus von großer Bedeutung. Das Spaltungsereignis, das erforderlich ist, um das Protein für die Fusion vorzubereiten, kann im Sekretionsweg durch Furin oder während der Infektion durch Wirtsproteasen der Atemwege auftreten. Influenzavirusstämme, die vom Wirtsfurin gespalten werden, sind hoch pathogen, da sie eine systemische Infektion verursachen. Bei Coronaviren ist die Beziehung zwischen der Spaltung des S-Proteins und seiner Fähigkeit zur Zell-Zell-Fusion gut bekannt. Gespaltene Proteine zeigen eine höhere Neigung zur Zell-Zell-Fusion. Die Einführung einer Mutation H716D in das Spike-Protein von MHV-A59 beeinträchtigte die Spaltung des Proteins stark und verzögerte die Zell-Zell-Fusion. Das MHV-2-Stamm-Spike-Protein wird nicht gespalten und die Mutation der Sequenz der MHV-A59-Spaltstelle mit der entsprechenden Sequenz des MHV-2 S-Proteins verzögert die Zell-Zell-Fusion. Die Einführung einer Spaltstelle in das MHV-2-Spike-Protein induziert die Bildung von Synzytien bei neutralem pH. In-vitro-Spike-Proteinspaltung spielt eine wichtige Rolle bei der Fusogenität, jedoch ist die Rolle bei der Virusfusion und Pathogenität weniger klar. Beispielsweise ist MHV-A59 mit der Mutation H716D dem Wildtyp-Virus hinsichtlich der Pathogenität sehr ähnlich. MHV-A59-Virusstamm, der in Gegenwart eines Furininhibitors zur Blockierung der Spike-Spaltung hergestellt wurde, tritt in Zellen mit einer Kinetik ein, die der des Wildtyp-Virus ähnlich ist. Darüber hinaus hat eine Studie von Hingley und Mitarbeitern gezeigt, dass die aus Leberhomogenaten von MHV-A59-infizierten Mäusen gereinigte Virusspitze nicht gespalten wurde, was weitere Beweise dafür liefert, dass die proteolytische Verarbeitung der Spitze für den Eintritt und die Ausbreitung in vivo nicht wesentlich ist. Bei Coronaviren mit einer durch Furin gespaltenen Spitze ist zu beachten, dass diese Protease zu einer Familie von Enzymen gehört, die Proproteinkonvertasen (PCs) genannt werden und neun Mitglieder haben. Zusammen mit Furin teilen sechs andere PC-Proteasen, PC1, PC2, PC4, PC5, PACE4 und PC7, dasselbe grundlegende Erkennungsmotiv: R / K- [X] 0,2,4,6-R / K (wobei X ist jede Aminosäure). Es bleibt zu bestimmen, ob andere PCs, die mit Furin verwandt sind, auch Coronavirus-Spike-Proteine erkennen und spalten können. Quelle und Schlussfolgerung im Teil 3von 3