Um ihr Nucleocapsid in die Wirtszelle abzugeben, sind sie auf die Fusion ihrer Hülle mit der Wirtszellmembran angewiesen. Das Spike-Glykoprotein (S) vermittelt den Viruseintritt und ist eine primäre Determinante für Zelltropismus und Pathogenese. Es wird als Fusionsprotein der Klasse I klassifiziert und ist für die Bindung an den Rezeptor in der Wirtszelle sowie für die Vermittlung der Fusion von Wirts- und Virusmembranen verantwortlich - ein Prozess, der durch wesentliche Konformationsänderungen des S-Proteins gesteuert wird. In diesem Aufsatz werden Coronavirus-Eintrittsmechanismen erörtert, die sich auf die verschiedenen Auslöser konzentrieren, die von Coronaviren verwendet werden, um die Konformationsänderung des S-Proteins auszulösen: Rezeptorbindung, Exposition bei niedrigem pH-Wert und proteolytische Aktivierung. Wir heben auch Gemeinsamkeiten zwischen Coronavirus S-Proteinen und anderen viralen Fusionsproteinen der Klasse I sowie charakteristische Merkmale hervor, die Coronaviren unterschiedliche Tropismus-, Pathogenitäts- und Wirts-Interspezies-Übertragungseigenschaften verleihen.Obwohl das erste Mitglied der Coronavirus-Familie in den 1930er Jahren entdeckt wurde, erlangten Coronaviren besondere Bekanntheit, als der Ausbruch des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS) in den Jahren 2002–2003 die Welt erschütterte. Das Interesse an dieser Familie von Viren wuchs nach dieser Epidemie und führte zur Identifizierung vieler neuer Familienmitglieder. Diese Episode beleuchtet auch die Fähigkeit von Coronaviren, über Arten zu springen. Bevor sie 2003 für die öffentliche Gesundheit an Bedeutung gewannen, waren die mit Coronaviren verbundenen Krankheiten hauptsächlich von veterinärmedizinischem Interesse. Coronaviren infizieren eine Vielzahl von Säugetieren und Vögeln und verursachen Atemwegserkrankungen, Darmkrankheiten und in einigen selteneren Fällen Hepatitis und neurologische Erkrankungen. Die Infektion kann akut oder anhaltend sein.Coronaviren werden in vier verschiedene Gattungen eingeteilt, die historisch auf serologischen Analysen und jetzt auf genetischen Studien beruhen: Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-CoV. Coronaviren gehören zur Coronavirinae-Unterfamilie, die zusammen mit Torovirinae die Coronaviridae-Familie in der Nidovirales-Ordnung bilden.Coronaviren sind umhüllte, kugelförmige oder pleiomorphe Viren mit typischen Größen im Bereich von 80 bis 120 nm. Sie besitzen ein 5'-verkapptes Einzelstrang-Positiv-Sense-RNA-Genom mit einer Länge zwischen 26,2 und 31,7 kb, dem längsten unter allen RNA-Viren. Das Genom besteht aus sechs bis zehn offenen Leserahmen (ORFs). Der erste ORF umfasst zwei Drittel des Genoms und codiert die Replikase-Proteine, während das letzte Drittel die Strukturprotein-Gene in einer festen Reihenfolge enthält: (HE) -S-E-M-N. Zwischen diesen Genen ist eine variable Anzahl von ORF vorhanden, die akzessorische Proteine codieren. Das Genom ist in ein helikales Nucleocapsid verpackt, das von einer vom Wirt abgeleiteten Lipiddoppelschicht umgeben ist. Die Virionhülle enthält mindestens drei virale Proteine, das Spike-Protein (S), das Membranprotein (M) und das Hüllprotein (E). Darüber hinaus enthalten einige Coronaviren auch eine Hämagglutininesterase (HE). Während die M- und E-Proteine an der Virusassemblierung beteiligt sind, ist das Spike-Protein der führende Mediator für den Viruseintritt. Das Spike-Protein ist auch der Hauptakteur bei der Bestimmung des Wirtsbereichs.Der Viruseintritt beruht auf einem feinen Zusammenspiel zwischen dem Virion und der Wirtszelle. Die Infektion wird durch Wechselwirkung des Viruspartikels mit spezifischen Proteinen auf der Zelloberfläche ausgelöst. Nach der anfänglichen Bindung des Rezeptors müssen umhüllte Viren ihre Hülle mit der Wirtszellmembran fusionieren, um ihr Nucleocapsid an die Zielzelle abzugeben. Das Spike-Protein spielt eine doppelte Rolle beim Eintritt, indem es die Rezeptorbindung und die Membranfusion vermittelt. Der Fusionsprozess beinhaltet große Konformationsänderungen des Spike-Proteins. Coronaviren verwenden eine Vielzahl von Rezeptoren und Triggern, um die Fusion zu aktivieren. Grundlegende Aspekte, die diesen ersten Schritt des viralen Lebenszyklus ermöglichen, bleiben jedoch erhalten. In diesem Aufsatz werden wir uns mit den Eintrittsstrategien von Coronaviren befassen und wie diese Mechanismen mit dem Tropismus und der Pathogenität des Wirts zusammenhängen.Verwendung von Coronavirus-Gattungen, Arten und Wirtsrezeptoren.GattungsspeziesrezeptorAlphacoronavirus • Alphacoronavirus 1, bestehend aus:Feline Coronavirus (FCoV) Serotyp 2 Aminopeptidase N.Canine Coronavirus (CCoV) Serotyp 2 Aminopeptidase N.Aminopeptidase N des übertragbaren Gastroenteritis-Virus (TGEV)• Humanes Coronavirus 229E Aminopeptidase N.• Humanes Coronavirus NL63 ACE2• Schweine-Epidemie-Durchfall-Coronavirus (PEDV) -Aminopeptidase N.• Rhinolophus Fledermaus-Coronavirus HKU2• Scotophilus Fledermaus-Coronavirus 512/05• Miniopterus Fledermaus-Coronavirus 1• Miniopterus Fledermaus-Coronavirus HKU8Betacoronavirus • Betacoronavirus 1, bestehend aus:Rinder-Coronavirus (BCoV) Neu 5,9 Ac2Humanes Coronavirus OC43 (HCoV-OC43) Neu 5,9 Ac2Equine Coronavirus (ECoV)Humanes enterisches Coronavirus (HECoV)Schweinehämagglutinierendes Enzephalomyelitis-Virus (PHEV)Atemwegs-Coronavirus (CrCoV)• Maus-Coronavirus, bestehend aus:Bestehende Arten des Maus-Hepatitis-Virus (MHV) CEACAM1Ratten-CoronavirusPapageientaucher-Virus• Humanes Coronavirus HKU9• Rousettus Fledermaus-Coronavirus HKU4• Tylonycteris Fledermaus-Coronvirus HKU5• SARSr-CoV (SARS-verwandtes Coronavirus) bestehend ausHumanes SARS-CoV ACE2Rhinolophus FledermausvirenGamma-Coronavirus • Vogel-Coronavirus, bestehend aus:IBVVerschiedene Coronaviren, die Truthahn, Fasan, Ente, Gans und Taube infizieren• Beluga Whale Coronavirus SW1Delta-Coronavirus • Bulbul-Coronavirus HKU11• Soor Coronavirus HKU12• Munia Coronavirus HKU13Das Spike-Protein ist ein großes Typ I-Transmembranprotein, das von 1.160 Aminosäuren für das infektiöse Vogelbronchitis-Virus (IBV) bis zu 1.400 Aminosäuren für das Katzen-Coronavirus (FCoV) reicht. Zusätzlich ist dieses Protein stark glykosyliert, da es 21 bis 35 N-Glykosylierungsstellen enthält. Spike-Proteine bilden auf der Virion-Oberfläche Trimere, die das charakteristische „Corona“ - oder kronenartige Erscheinungsbild bilden. Die Ektodomäne aller CoV-Spike-Proteine teilt dieselbe Organisation in zwei Domänen: einer N-terminalen Domäne namens S1, die für die Rezeptorbindung verantwortlich ist, und einer C-terminalen S2-Domäne, die für die Fusion verantwortlich ist. Ein bemerkenswerter Unterschied zwischen den Spike-Proteinen verschiedener Coronaviren besteht darin, ob sie während des Zusammenbaus und der Exozytose von Virionen gespalten werden oder nicht. Mit einigen Ausnahmen enthalten die Virionen in den meisten Alphacoronaviren und dem Betacoronavirus SARS-CoV ein nicht gespaltenes Spike-Protein, während in einigen Beta-und allen Gammacoronaviren das Protein zwischen den S1- und S2-Domänen gespalten ist, typischerweise durch Furin, einen im Golgi-Apparat residente Wirtsprotease. Interessanterweise weisen innerhalb der Betacoronavirus-Maus-Hepatitis-Virus (MHV) -Spezies verschiedene Stämme wie MHV-2 und MHV-A59 unterschiedliche Spaltungsanforderungen auf. Dies hat wichtige Konsequenzen für ihre Fusogenität, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die S2-Untereinheit ist die am besten konservierte Region des Proteins, während die S1-Untereinheit selbst bei Arten eines einzelnen Coronavirus nacheinander divergiert. Der S1 enthält zwei Subdomänen, eine N-terminale Domäne (NTD) und eine C-terminale Domäne (CTD). Beide können als Rezeptorbindungsdomänen (RBDs) fungieren und verschiedene Proteine und Zucker binden.Das Coronavirus-Spike-Protein ist ein Fusionsprotein der Klasse I. Die Bildung einer α-helikalen Coiled-Coil-Struktur ist charakteristisch für diese Klasse von Fusionsproteinen, die in ihren C-terminalen Teilbereichen Regionen enthalten, von denen vorhergesagt wird, dass sie eine α-helikale Sekundärstruktur aufweisen und Coiled-Coils bilden. Influenza-Hämagglutinin-Protein HA ist das prototypische Mitglied der Klasse-I-Fusionsproteinfamilie und eines der bisher am besten charakterisierten. HA wird als HA0-Vorläufer synthetisiert und zu Trimeren zusammengesetzt. Das Protein wird durch Spaltung von HA0 in HA1 und HA2 fusionskompetent. Das Fusionspeptid, eine sehr konservierte hydrophobe Sequenz, befindet sich am N-Terminus von HA2. In der Vorfusionskonformation wird die zentrale Coiled-Coil des Trimers durch drei lange Helices mit drei kürzeren Helices gebildet, die um sie herum gepackt sind. In dieser Konformation ist das Fusionspeptid geschützt und in der Trimer-Grenzfläche vergraben. Während der Fusion treten zwei Hauptkonformationsänderungen auf. Bei der endosomalen Ansäuerung wird ein unstrukturierter Linker helikal, was die Bildung einer langen Helix im N-terminalen Teil ermöglicht. In dieser Konformation, die als Prehairpin bezeichnet wird, wird das Fusionspeptid in Richtung der Zielmembran projiziert, wo es dann eingebettet wird und die Virus- und Zielzellmembranen verbindet. Die zweite Konformationsänderung besteht in der Inversion der C-Helix, die sich in die Rillen der N-terminalen trimeren Coiled-Coils packt und ein Sechs-Helix-Bündel (6HB) bildet. In der resultierenden Konformation werden die Transmembrandomäne und das in der Zielmembran verankerte Fusionspeptid nahe beieinander gebracht, was das Zusammenführen von Virus- und Zellmembranen erleichtert.Coronavirus-Spike-Proteine enthalten zwei Heptad-Wiederholungen in ihrer S2-Domäne, ein Merkmal, das für virale Fusionsproteine der Klasse I typisch ist. Heptad-Wiederholungen umfassen ein repetitives Heptapeptid abcdefg, wobei a und d hydrophobe Reste sind, die für die Bildung von Coiled-Coil charakteristisch ist und die am Fusionsprozess teilnehmen. Für SARS-CoV und MHV wurden die Post-Fusion-Strukturen der HR gelöst; sie bilden das charakteristische Sechs-Helix-Bündel. Die funktionelle Rolle von MHV und SARS-CoV HR wurde durch Mutation von Schlüsselresten und durch Hemmungsexperimente mit HR2-Peptiden bestätigt .Die wichtige Rolle des Spike-Proteins beim Zelltropismus wurde mit chimären Viren gezeigt. Es gibt viele Stämme des Maus-Hepatitis-Virus (MHV), Viren, die hauptsächlich Gehirn und Leber infizieren. Aufgrund der unterschiedlichen Krankheitsbilder, die mit den verschiedenen MHV-Stämmen verbunden sind, wurde die Beteiligung ihres Spike-Proteins am Gewebetropismus ausführlich untersucht. Der Stamm JHM ist hochvirulent und verursacht eine schwere Enzephalitis, die oft tödlich ist, aber schlecht hepatotrop. Der Stamm MHV-A59 verursacht Hepatitis und leichte Enzephalitis. MHV-2 ist stark hepatotrop. Durch die Verwendung von chimären Viren zwischen diesen verschiedenen Stämmen wurde gezeigt, dass das S-Protein mit dem Tropismus und der Pathogenese von MHV verbunden ist. Die Einführung von JHM- oder MHV-2 S-Genen im MHV-A59-Hintergrund erhöht die Neurovirulenz und den Hepatotropismus des rekombinanten Virus. Der Ersatz der JHM S-Proteinsequenz durch das MHV-A59 S-Gen im JHM-Hintergrund führt jedoch nicht zu Hepatotropismus, was darauf hindeutet, dass andere Faktoren den Virustropismus modulieren. Ein mutierter MHV-A59-Stamm mit verändertem Tropismus wurde aus persistent infizierten Mikrogliazellen isoliert. Die einzelne Mutation Q159L in der S1-Domäne ist für eine verringerte Replikation in der Leber und einen geringen Hepatotropismus des Virus verantwortlich. Die wichtige Rolle des Spike-Proteins beim Tropismus wurde auch für andere Coronaviren gezeigt. IBV ist ein wichtiger Erreger von Hausgeflügel, der sich in den Atemwegen, aber auch in Epithelzellen aus Niere, Eileiter und Darm repliziert. In vitro infizieren klinische IBV-Stämme nur Hühnerembryo-Nierenzellen und wachsen auf embryonierten Eiern. Der IBV-Beaudette-Stamm ist ein abgeschwächter Stamm, der durch serielle Passage von IBV auf Eiern erhalten wurde. IBV Beaudette infiziert neben Nierenzellen von Hühnerembryonen auch CEF-, BHK-21- und Vero-Zellen. Die Substitution des S-Gens im Beaudette-Hintergrund durch das des IBV M41-Stamms beschränkt den Tropismus des Virus auf primäre Hühnerzellen. In vivo weist dieses chimäre Virus jedoch den abgeschwächten Phänotyp von Beaudette auf. Diese Daten zeigen, dass die Veränderung des Tropismus von Beaudette in der Zellkultur hauptsächlich durch das S-Protein bestimmt wird, obwohl die Avirulenz auch aus der Abschwächung von Mutationen in anderen Genen resultiert.Katzenartige Coronaviren (FCoV) sind ein faszinierendes Beispiel für die kritische Beteiligung des Spike-Proteins an Tropismus und Pathogenese. Innerhalb dieser Alphacoronavirus-Spezies gibt es zwei bekannte Serotypen, 1 und 2, basierend auf den serologischen und genetischen Eigenschaften ihrer Spitze. Darüber hinaus gibt es in jedem Serotyp zwei Biotypen, die beide mit einem extrem kontrastierenden pathologischen Potenzial verbunden sind. Katzen werden häufig mit dem katzenartigen enterischen Coronavirus (FECV) infiziert, einem Biotyp, der normalerweise asymptomatische bis milde Infektionen des enterischen Trakts hervorruft und möglicherweise eine Persistenz im Wirt hervorruft. Im Gegensatz dazu entwickeln einige FCoV-infizierte Katzen sporadisch eine ausnahmslos tödliche immunvermittelte Krankheit, die als katzenartige infektiöse Peritonitis (FIP) bezeichnet wird. In diesem Fall wird der Erreger als katzenartiges infektiöses Peritonitis-Virus (FIPV) bezeichnet. Ein auffälliges Merkmal von FIPVs, das sie von FECVs unterscheidet, ist ihre Fähigkeit, sich in Monozyten und Makrophagen effizient zu replizieren. Es wird angenommen, dass dieser Wechsel des Tropismus vom Darmepithel zu beweglichen Monozyten / Makrophagen-Zellen ein entscheidender Wendepunkt für die Entwicklung von FIP ist, da er die Verbreitung von Viren im gesamten Wirt ermöglicht.
Das derzeitige Verständnis ist, dass Mutationen in FECV in einem persistent infizierten Wirt dazu führen, dass es sich in das virulente FIPV verwandelt. Während angenommen wurde, dass Mutationen oder Deletionen in bestimmten Genen wie 3c und 7b mit dem Auftreten von FIPV assoziiert sein könnten, sind die ursächlichen Mutationen für den Biotypwechsel noch unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass Mutationen im Spike-Gen eine Schlüsselrolle beim Übergang des Tropismus vom Darmepithel zu Makrophagen spielen können. Rottier und Kollegen haben sich auf das genetisch nahe und laborangepasste Typ-2-Paar FECV 79–1683 und FIPV 79–1146 konzentriert. Während beide Viren ähnliche Wachstumseigenschaften in etablierten Katzenepithelzellen aufweisen, kann nur FIPV 79–1146, nicht jedoch FECV 79–1683 Makrophagen effizient infizieren und replizieren. Unter Verwendung eines gezielten RNA-Rekombinationssystems konnten die Autoren rekombinantes chimäres Virus erzeugen, um Regionen des Genoms zu bestimmen, die für die Infektion von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wichtig sind. Sie fanden heraus, dass der Austausch des FIPV 79–1146 S-Gens mit dem von FECV 79–1683 im genetischen Hintergrund des FIPV 79–1146 die Fähigkeit des chimären rekombinanten Virus, Makrophagen zu infizieren, im Vergleich zum rekombinanten Wildtyp-FIPV 79–1146 stark verringerte. Darüber hinaus wurden zusätzliche Chimären erzeugt, um die für den Makrophagen-Tropismus wichtigen Spike-Regionen genauer abzubilden. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die C-terminale Region des Spikes (vom Rest 874 bis zum C-Terminus), jedoch nicht die N-terminale Region (die die S1-Rezeptorbindungsdomäne enthält) für den Makrophagen-Tropismus in diesem System verantwortlich ist. Insgesamt zehn Aminosäuresubstitutionen unterscheiden die C-terminalen Regionen von FECV 79–1683 und FIPV 79–1146. Die genauen Mutationen, die den Tropismusschalter verursachen, müssen jedoch noch bestimmt werden.Der erste identifizierte Coronavirus-Rezeptor war 1991 der MHV-Rezeptor. MHV bindet an das Adhäsionsmolekül CEACAM1 (Carcinoembryonales Antigen-Zell-Adhäsionsmolekül), um Zellen zu infizieren. CEACAM1 ist ein Typ I-Transmembranprotein, das zur Immunglobulin-Superfamilie gehört. CEACAM1 ist ein multifunktionales Protein, das unter anderem eine Rolle bei der Adhäsion und der Signalübertragung von Zellen spielt. Die CEACAM1-Ektodomäne enthält vier Ig-konstante Regionen wie Domänen, N, A1, B und A2. Die N-terminale Domäne N von CEACAM1 ist an der MHV-Bindung beteiligt. Es gibt zwei Allelformen von CEACAM1, CEACAM1a und CEACAM1b. Sie können beide als Rezeptoren fungieren, die Bindung durch CEACAM1a ist jedoch viel effizienter. Die Beteiligung der Rezeptornutzung und des Tropismus von MHV-Stämmen wurde untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Neurovirulenz von JHM mit einer raschen Ausbreitung des Virus im Gehirn verbunden ist, das teilweise unabhängig von CEACAM1 ist. In vitro benötigt MHV-JHM CEACAM1 für den Eintritt, in vivo kann JHM jedoch Ceacam - / - Mäuse infizieren, jedoch mit einer 100-fach höheren letalen Dosis. Infolgedessen wurde vorgeschlagen, dass JHM in Abwesenheit von CEACAM1 einen alternativen, weniger wirksamen und noch zu bestimmenden Rezeptor verwendet, um eine Infektion auszulösen. Nach der Primärinfektion konnte sich das Virus sehr schnell vermehren, indem die Zell-Zell-Fusion unabhängig vom Rezeptor durchgeführt wurde (rezeptorunabhängige Ausbreitung). In vivo ist MHV-A59 für die Infektion streng von CEACAM1 abhängig, aber eine anhaltende Infektion von Mauszellen führt zur Entstehung von Viren mit erweitertem Tropismus. Das MHV / BHK-Virus infiziert Zellen in Heparansulfat-abhängiger und CEACAM1-unabhängiger Weise, da zwei Heparansulfat-Bindungsstellen im S-Protein erworben wurden. Es wurde gezeigt, dass beide Bindungsstellen erforderlich sind, um den CEACAM1-unabhängigen Phänotyp zu erhalten.Für den JHM-Stamm existieren viele Isolate, die sich in ihren Neurovirulenzniveaus unterscheiden. Die Virulenz korreliert mit der Länge einer hypervariablen Region innerhalb von S1. Das Isolat MHV-4 von JHM enthält die längste Region und ist mit einer unabhängigen CEACAM1-Zell-Zell-Fusion und -Verbreitung assoziiert. Es wurde vermutet, dass Konformationsänderungen des Spike-Proteins durch eine weniger stabile Assoziation der S1- und S2-Untereinheiten erleichtert werden. Dies legt nahe, dass je höher das fusogene Potential des Spike-Proteins ist, desto weniger hängt das Virus von seinem Rezeptor für den Eintritt ab.Unter den Alphacoronaviren können zwei humane Viren (HCoV-229E und HCoV-NL63) zusammen mit Viren gefunden werden, die Tiere infizieren und für schwere Krankheiten verantwortlich sein können: Übertragbare Gastroenteritis CoV (TGEV) und Hunde-CoV (CCoV) verursachen bei Schweinen und Hunden enterische Erkrankungen während Katzen-Coronaviren bei Katzen enterische und systemische Erkrankungen verursachen.Während Serotyp 2 FCoV relativ detailliert untersucht wurde, insbesondere weil sie sich in vitro leichter vermehren, sind Serotyp 1 FCoV, die klinisch relevanter sind, da sie häufiger auftreten, weniger gut verstanden. Und obwohl davon ausgegangen werden kann, dass sich Viren beider Serotypen während des größten Teils ihres Lebenszyklus ähnlich verhalten, bleibt zu untersuchen, ob der gleiche oder unterschiedliche Satz von Mutationen für den Biotypwechsel in den beiden Serotypen verantwortlich ist. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, um Serotyp 1 FCoV zu untersuchen. Solche Bemühungen würden Aufschluss über die FCoV-Pathogenese geben.Der Unterschied im Tropismus, der durch S-Proteine vermittelt wird, resultiert aus verschiedenen Mechanismen, die mit den beiden Hauptfunktionen des Proteins verbunden sind: Rezeptorbindung und Fusion, die weiter diskutiert werden. Quelle ncbi.nlm.nih.gov