Um die Abläufe in den Zellen genau zu verstehen, werden die zu untersuchenden Objekte mittels fluoreszierender Proteine markiert. Ob diese Methode auch in der Nanoskopie eingesetzt werden kann, ohne dass sich Aggregate bilden, konnte nun geklärt werden.
Modernste optische Technologien, wie die super-auflösende Nanoskopie, liefern faszinierende Einblicke in das Innere lebender Zellen. Kleinste Strukturen und molekulare Abläufe lassen sich exakt darstellen. Um diese Vorgänge sichtbar zu machen, müssen die zu untersuchenden Objekte genau markiert werden. Bisher war fraglich, ob die in der konventionellen Bildgebung zur Markierung und Visualisierung eingesetzten fluoreszierenden Proteine auch für den Einsatz in der super-auflösenden Mikroskopie geeignet sind.
Wissenschaftler des Göttinger Exzellenzclusters CNMPB haben untersucht, ob bekannte fluoreszierende Proteine für die Nanoskopie anwendbar sind. Bekannt ist, dass viele Markerproteine aufgrund ihrer relativ großen Größe dazu neigen, Aggregate zu bilden, die Artefakte in nanoskopischen Messungen hinterlassen können. Deshalb interessierten sich die Forscher besonders für die Frage, ob sich die Markierung auf die strukturelle Organisation der Proteine auswirkt, die mit Hilfe der Nanoskopie dargestellt werden sollen. Fluoreszierende Proteine sind als Mittel zur Markierung in der Nanoskopie und für die biomedizinische Forschung gut geeignet und generell anwendbar. Insbesondere die auf dem Einsatz unnatürlicher Aminosäuren zugrunde liegende Fluoreszenz-Markierung gilt als effiziente Methode. „Genetisch kodierte, also durch Genmanipulation in lebende Zellen eingeschleuste Fluoreszenzmarker sind für die Untersuchung molekularer Strukturen und Prozesse besonders interessant, weil sie einfach zu handhaben und für die Zellen gut verträglich sind“, sagt Rizzoli. Kleinere Marker bieten oft Vorteile im Einsatz für die hoch-auflösende Mikroskopie. Die Darstellung von Endosomen in Form von ungleichmäßigen kreisförmigen Kompartimenten gelingt mittels der Markierung von Transferrin Rezeptoren durch kleine Aptamere (links). Die Markierung mit größeren Antikörpern (rechts) lässt eine Identifizierung der endosomalen Formen kaum zu. © Felipe Opazo / CNMPB
Die Wissenschaftler konzentrierten sich auf insgesamt 26 Proteine, von denen bekannt ist, dass sie zur Bildung multimolekularer Aggregate neigen. Die Forscher verglichen die strukturelle Organisation der Proteine mit und ohne Fluoreszenzmarkierung. Für den Vergleich wurde der kleinste momentan erhältliche Marker, die synthetische Aminosäure Propargyl-L-Lysine (PRK), gewählt und in die kodierende Sequenz eines Zielproteins eingebaut. Die Visualisierung des Proteins erforderte die Anheftung einer synthetischen, fluoreszierenden Gruppe durch „Click-Chemie”. Dabei handelt es sich um eine sehr schnelle und selektiv organische Reaktion, die als Standardtechnik zur Markierung und Modifizierung von Biomolekülen etabliert ist. Mittels super-auflösender Mikroskopie-Verfahren verglichen die Wissenschaftler anschließend die Organisation der markierten und unmarkierten Zielproteine in Zellen. Lediglich bei sechs der 26 untersuchten Proteine ließ sich eine leichte Beeinträchtigung der Proteinorganisation erkennen. In allen anderen Fällen bildeten die Proteine mit und ohne Fluoreszenzmarkierung vergleichbare molekulare Strukturen. Insgesamt bewerteten die Forscher daher die von ihnen gewählte Markierung als taugliches Instrument für die Nanoskopie. Das grün-fluoreszierende Protein (GFP) ist eines der wichtigsten Instrumente für die Fluoreszenzmikroskopie. Die Abbildung zeigt Zellen, die das VAMP4-Protein bilden, an das ein GFP angehängt wurde. Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird erkennbar, dass das markierte Protein (grün) in verschiedenen Zellen der gleichen Probe unterschiedlich lokalisiert vorliegt. Während bei einigen Zellen breite fleckige Areale um den Zellkern (blau) herum sichtbar sind (rechts), ist das markierte Protein in anderen Zellen relativ homogen um den Zellkern herum angeordnet (links). © Vreja et al., 2015 Originalpublikation: Super-resolution Microscopy of Clickable Amino Acids Reveals the Effects of Fluorescent Protein tagging on Protein Assemblies Ingrid C. Vreja et al.; ACS Nano, doi: 10.1021/acsnano.5b04434; 2016
